這一成果不僅展示了ARTP在真菌遺傳改良中的能力，也再次驗(yàn)證了ARTP在合成生物學(xué)與生物制造領(lǐng)域的性能。

研究背景：纖維素酶生產(chǎn)的“攔路虎”

里氏木霉是工業(yè)纖維素酶生產(chǎn)的主要真菌菌株，但其生長和產(chǎn)酶過程極易受到糠醛的抑制?？啡┦悄举|(zhì)纖維素生物質(zhì)預(yù)處理過程中產(chǎn)生的一種細(xì)胞毒性副產(chǎn)物，廣泛存在于水解液中，嚴(yán)重制約了生物煉制的效率。雖然目前已有一些遺傳策略試圖增強(qiáng)菌株的耐受性，但往往伴隨著代謝負(fù)擔(dān)，且針對里氏木霉糠醛耐受性的研究仍然十分有限。

ARTP誘變：高效創(chuàng)制優(yōu)異突變體

為了攻克這一難題，研究團(tuán)隊(duì)首先利用ARTP常壓室溫等離子體生物育種儀對野生型菌株CBS 999.97進(jìn)行了誘變處理。在誘變過程中，團(tuán)隊(duì)通過精確控制處理時(shí)間，發(fā)現(xiàn)當(dāng)處理時(shí)長為240秒時(shí)，菌株的致死率達(dá)到90.45%，這一數(shù)值處于平衡突變效率與存活率的范圍內(nèi)。

 圖1  CBS 999.97在ARTP誘變處理不同暴露持續(xù)時(shí)間下的致死率

經(jīng)過兩輪梯度篩選（分別使用4 mM和8 mM糠醛作為篩選壓力），研究團(tuán)隊(duì)成功獲得了一株能在8 mM糠醛濃度下持續(xù)生長的突變菌株CBS 3-16-1。這一結(jié)果充分展示了ARTP誘變技術(shù)在創(chuàng)造優(yōu)異遺傳性狀方面的高效性與便捷性。

 圖2 糠醛濃度增加條件下CBS 3-16-1與CBS 999.97的生長比較

表型鑒定：耐受性顯著提升，生長性能無折損

獲得突變株后，團(tuán)隊(duì)對其進(jìn)行了全面的生理生化分析。結(jié)果顯示，與野生型菌株相比，突變株CBS 3-16-1在較高濃度的糠醛環(huán)境下表現(xiàn)出更強(qiáng)的生存能力，而野生型菌株的生長則受到明顯抑制。并且突變株在獲得高耐受性的同時(shí)，未犧牲其生長與產(chǎn)酶性能。數(shù)據(jù)顯示，突變株與野生型在菌絲干重、分生孢子萌發(fā)率以及胞外蛋白分泌量等關(guān)鍵指標(biāo)上均無顯著差異。此外，兩者的濾紙酶活（FPA）也保持一致，說明突變所獲得的耐受性并未對菌株的纖維素酶合成能力產(chǎn)生負(fù)面影響。

圖3  CBS 3-16-1與CBS 999.97的表型和生理學(xué)比較

這一發(fā)現(xiàn)對于工業(yè)應(yīng)用至關(guān)重要，它意味著利用ARTP誘變獲得的優(yōu)良性狀可以穩(wěn)定遺傳，且不影響菌株的發(fā)酵生產(chǎn)能力。后續(xù)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，突變株在連續(xù)傳代培養(yǎng)中表現(xiàn)出了良好的遺傳穩(wěn)定性。

產(chǎn)酶提升：耐受性與酶活“雙豐收”

研究中對基因敲除菌株的產(chǎn)酶評估也具工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。在含有糠醛的脅迫條件下，敲除Tr80437基因的菌株在培養(yǎng)第7天時(shí)，其分泌的胞外蛋白濃度約為對照菌株的2.4倍，濾紙酶活（FPA）更是達(dá)到了對照菌株的2.8倍。

這一結(jié)果表明，Tr80437基因的缺失不僅賦予了菌株更強(qiáng)的糠醛耐受性，還在脅迫環(huán)境下顯著提升了纖維素酶的合成與分泌效率。這一發(fā)現(xiàn)為構(gòu)建適應(yīng)木質(zhì)纖維素水解液復(fù)雜環(huán)境的工業(yè)菌株提供了遺傳改造靶點(diǎn)。

 圖4  Tr80437基因缺失對4 mM糠醛脅迫下T. reesei蛋白分泌和纖維素酶產(chǎn)生的影響

結(jié)語

本研究不僅發(fā)現(xiàn)了一個(gè)具有重要應(yīng)用價(jià)值的新基因Tr80437，更展示了ARTP常壓室溫等離子體誘變育種儀在絲狀真菌遺傳改良中的威力。作為一種操作簡便、誘變效率高、無需有毒化學(xué)試劑的新型誘變工具，ARTP為微生物育種領(lǐng)域提供了強(qiáng)有力的技術(shù)推動。從性狀創(chuàng)制到基因挖掘，ARTP助力科研人員高效完成研究閉環(huán)，再次彰顯了其在合成生物學(xué)領(lǐng)域的廣闊應(yīng)用前景。